Biologia - Zespół Szkół Elektronicznych i Samochodowych

Mikroskopy

Mikroskop fluorescencyjny

Znaczniki fluorescencyjne użyte do barwienia komórek wykrywa się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Jest on podobny do zwykłego mikroskopu świetlnego, poza tym że światło przechodzi przez dwa zestawy filtrów. Zestaw pierwszy (1) filtruje światło przed jego dotarciem do preparatu, przepuszczając tylko te długości fali, które pobudzają odpowiedni znacznik fluorescencyjny. Zestaw drugi (2) zatrzymuje to światło, a z kolei przepuszcza tylko te długości fal, które są emitowane przez znacznik fluorescencyjny. Znakowane obiekty ukazują się w jasnym kolorze na ciemnym tle.

Znaczniki fluorescencyjne.

Dzielące się komórki widziane w mikroskopie fluorescencyjnym po wybarwieniu specyficznymi znacznikami fluorescencyjnymi. Barwniki fluorescencyjne absorbują światło o pewnej długości fali, a emitują światło o innej, dłuższej fali. Niektóre z nich wiążą się specyficznie z poszczególnymi cząsteczkami w komórkach, co pozwala badać ich umiejscowienie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Przykładem jest pokazane tu specyficzne wyznakowanie DNA (kolor zielony). Inne znaczniki mogą być sprzężone z cząsteczkami przeciwciał i tworzą wtedy bardzo szybkie i wszechstronne barwniki, które wiążą się wybiórczo z poszczególnymi rodzajami makrocząsteczek i dają obraz ich rozmieszczenia w komórce. W pokazanym przykładzie białka mikrotubul wrzeciona mitotycznego wybarwiono na kolor czerwony przeciwciałem fluorescencyjnym.

Skaningowy mikroskop elektronowy

W skaningowym mikroskopie elektronowym (SME) preparat, który pokryto bardzo cienką warstwą metalu ciężkiego, jest skanowany wiązką elektronów skupioną na preparacie przez cewki elektromagnetyczne, które w mikroskopach elektronowych działają jako soczewki. W miarę bombardowania przez wiązkę każdego kolejnego punktu powierzchni preparatu detektor mierzy liczbę elektronów ugiętych (rozproszonych) lub odbitych, które traktuje się jako kontrolę intensywności kolejnych punktów na obrazie powstającym na ekranie kontrolnym. Mikroskop tworzy wyraziste obrazy trójwymiarowe przedmiotów o dużej głębi ostrości i rozdzielczości od 3 nm do 20 nm, zależnie od typu preparatu.

Transmisyjny mikroskop elektronowy.

Transmisyjny mikroskop elektronowy (TME) jest w zasadzie podobny do odwróconego mikroskopu świetlnego, ale zamiast wiązki światła używa wiązki elektronów, a do skupienia wiązki - zamiast soczewek szklanych - cewek magnetycznych. Preparat, który umieszcza się w próżni, musi być niezwykle cienki. Kontrast uzyskuje się zazwyczaj przez nałożenie barwników zawierających elektronowo gęsty metal ciężki, który lokalnie albo pochłania, albo rozprasza elektrony, usuwając je z wiązki w czasie jej przechodzenia przez preparat. TME umożliwia użyteczne powiększenie aż do miliona razy i - dla preparatów biologicznych - rozdzielczość około 2 nm.

Sondy znakowane złotem.

W ten sam sposób, w jaki barwniki fluorescencyjne związane z sondami molekularnymi pozwalają na wykrycie specyficznych cząsteczek w mikroskopie świetlnym, malutkie cząstki złota można sprzęgać z sondami molekularnymi w celu wykrycia umiejscowienia specyficznych cząsteczek za pomocą mikroskopu elektronowego. W typowym przypadku przeciwciała o znanej swoistości łączą się z elektronowo gęstymi kuleczkami koloidalnego złota (5-20 nm średnicy) i stosuje się do znakowania cienkich skrawków komórek lub tkanek; proces ten określa się jako mikroskopię elektronową z użyciem immunozłota. Kuleczki złota wyglądają w mikroskopie elektronowym jak małe czarne kropki. Pokazany przykład przedstawia cienki skrawek komórki trzustki wydzielającej insulinę, w którym przeciwciało przeciwinsulinowe znakowane złotem ujawniło wewnątrzkomórkowe umiejscowienie insuliny.